【冬宫学府】如何处理“实时荧光定量pcr（RT-qPCR）”数据。

白氿 · 发表于 2025-1-1 13:14:55

本帖最后由白氿于 2025-1-1 13:21 编辑
实时荧光定量 PCR，其英文全称为 Quantitative Real-time polymerase chain reaction。这是一种应用于 DNA 扩增反应的特殊方法，它借助荧光化学物质，对每次聚合酶链式反应（PCR）循环结束后的产物总量进行精准测定。具体而言，该方法可通过内参法或外参法，针对待测样品里的特定 DNA 序列开展定量分析工作。

作为分子生物学中基础实验之一，qpcr的数据处理是每个生物学子都要学会的实验技能。

那么今天，猫猫就来带领大家一起处理一次qpcr的数据吧~

使用到的软件：BioRadCFX manager；Excel；GraphPad Prism

首先，我们把qpcr仪器上的程序用u盘拷贝到自己的电脑上，此时，文件应该是文件名.pcrd格式。用BioRadCFX manager把该文件打开，如果没有布板（edit plate）的请先布板。完成布板后，我们先检查熔解曲线（Melt Curve），一个基因的结果如果呈现特异性的单峰（如图 1），则说明结果可信，如果呈现杂乱无章的峰（猫猫的实验结果都很好哈，没有负面例子的图），则不可信，建议重新设计qpcr引物。

确认结果可信后，我们需要导出原始数据，点击“Gene Expression”，在“Experiment Setting”中选择内参基因，现在△Cq中检查内参基因在样本中表达是否平齐，建议在（1.0±0.2），然后在△△Cq界面下方，找到“Gene Expression Data Table”，右键点击，选择“Export to excel”，导出原始数据为excel格式。

打开GraphPad Prism，新建“Grouped”，勾选“Enter or import data in a new table”和“Enter and plot error values already calculated elsewhere”中“Mean SEM N”格式，新建表格。将基因名填在左侧，样本名填在上方，将excel表格中的原始数据Expression值填在“Mean”对应格，“Expression SEM”值填在“SEM”对应格（如图2）。

在Graphs里选“Data1”，选择“Summary Data”中“Interleaved bars”格式，图上方修改为“斜体基因名”（如果是人类基因），Y轴旁修改为“Relative mRNA levels”，X轴标题删除，酌情删除图例，自行修改配色和字体，最终结果展示如图 3。

这样，一个基因的数据就处理好了。

那么，多个基因怎么处理呢？

有两种方法，一种是将多个基因数据处理在一个图上，当进行基因筛选时可以采用这种方法，好处是所有基因可以一起比较，哪个基因相对于其他基因发生改变更加直观。另一种是单独制作每个基因的图像，然后使用layout功能，将图像整齐排列，好处是，每个基因内部样本的变化更加直观，可以清晰看出单个基因在不同样本中的表达情况。（如果有100个追随我就更新哈，感觉根本无人在意）

那么，qpcr的数据大致就是这样处理了，当然，qpcr实验涉及步骤众多，数据中cq值，循环数也都蕴藏着不同的信息，detail attention 是众多伟大科学问题被发现的重要前提，大家一起多多努力吧~

泥潭不会真的有分子生物学方向的其他朋友吧。。。。。。。。

如果感兴趣，猫猫还可以更新比如流式数据分析，cck8，elisa什么的。。。。。。。真的会有人看吗。。。。。

求追随~虽然大概率大部分坛友这辈子和下辈子都用不上，但我还是求追随~